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ÿþVor dem Hintergrund einer früheren Studie [25], in der gezeigt wurde, puma basket heart white dass ErbB4 mit Bcl-2 interagiert und dass EGFR / EGFRvIII und ErbB4 eine strukturelle Homologie aufweisen, untersuchten wir, ob EGFR / EGFRvIII mit den drei proapoptotischen Proteinen, die mit Bcl-2 koexprimieren, einen Komplex bildet Rezeptoren. Wie aus den Ergebnissen der Immunpräzipitation (IP) / Western-Blotting unter Verwendung eines EGFR-Antikörpers für IP (1c) hervorgeht, bildet EGFRvIII in GBM-Xenotransplantaten mit endogenem EGFRvIII (D-270 MG) einen Komplex mit PUMA, jedoch nicht mit Bax und Bmf und D-317 MG) und mit stabil transfiziertem EGFRvIII (U87MGEGFRvIII). In ähnlicher Weise wurde gezeigt, dass PUMA in drei EGFR-exprimierenden GBM-Zelllinien mit EGFR coimmunopräzipitiert (1d).

Die Regressionsanalyse zeigt ferner, dass die Koexpression von EGFR allein, PUMA allein und EGFR / PUMA signifikant mit dem Gliomgrad korreliert (2a). Zwei repräsentative immungefärbte Gliome sind in 2b gezeigt, in denen ein GBM (oberes Feld) sowohl puma basket lack für EGFR / EGFRvIII als auch für PUMA eine positive Färbung zeigt und im Gegensatz dazu ein Grad II-Gliom (unteres Feld) für beide Proteine   negativ färbt. Der im EGFR / EGFRvIII-IHC verwendete Antikörper erkennt ein C-terminales Epitop, das sowohl im EGFR- als auch im EGFRvIII-Rezeptor puma basket platform beige vorhanden ist, und aufeinanderfolgende Tumorschnitte wurden in diesen Studien verwendet. Der hohe Grad der EGFR / EGFRvIII-PUMA-Co-Expression in primären GBM-Proben stimmt mit den Beobachtungen in 1 mit den GBM-Zelllinien überein.

Um zu untersuchen, ob PUMA für die Induktion von Apoptose in GBM essentiell ist, wurde PUMA-spezifische siRNA verwendet, um die PUMA-Expression und die Reaktion von U87MG-GBM-Zellen, die sehr niedrige EGFR-Spiegel exprimieren, auf Anisomycin, einen potenten Induktor von, herunter zu regulieren Apoptose [38] wurde untersucht. Wie in 3a gezeigt, zeigte der TUNEL-Assay, dass PUMA Knockdown U87MG-Zellen resistent gegen Apoptose (2,5%) macht, induziert durch 48-stündige Anisomycin-Behandlungen. Im puma basket platform core Gegensatz dazu erfahren mit der Kontroll-siRNA transfizierte U87MG-Zellen eine signifikante Anisomycin-induzierte Apoptose (45,5%). In dem Assay repräsentieren die gelben fusionierten Signale nuklear fragmentierte DNA.

Wie erwartet zeigten unbehandelte Zellen keinen Hinweis auf Apoptose (Daten nicht gezeigt). Das Western Blot (3b) zeigte, dass die PUMA-Expression durch die PUMA-spezifische siRNA spezifisch und effizient herunterreguliert wurde. Auswirkungen der Herunterregulierung der PUMA-Expression und der erhöhten EGFRvIII-Expression auf die Induktion von Apoptose in GBM-Zellen. Das Ausmaß der Apoptose wird wie folgt berechnet: (Anzahl der apoptotischen Kerne) / (Gesamtanzahl der Kerne). In beiden Panels wurden 250-300 Zellen in jedem Experiment untersucht und drei unabhängige Experimente wurden durchgeführt, um Mittelwerte und Standardabweichungen abzuleiten. (A) PUMA-Expressions-Knockdown macht GBM-Zellen resistent gegen Apoptose, wie durch den TUNEL-Assay angezeigt.

U87MG-Zellen wurden mit Kontroll-siRNA und PUMA-spezifischer siRNA 24 Stunden lang transfiziert und 48 Stunden lang 100 ng / ml Anisomycin, einem wirksamen Apoptose-Induktor, ausgesetzt. Die Zellen wurden dann dem TUNEL-Assay unterzogen, um das Ausmaß der Apoptose zu bestimmen. Rote Fluoreszenz: mit Propidiumiodid gefärbte Kerne. Grüne Fluoreszenz: fragmentierte DNA. Gelbe fusionierte Signale: Kernfragmentierte DNA. ( Western Blot zeigt einen spezifischen und effizienten PUMA-Expressions-Knockdown nach der Transfektion von puma basket platform metallic PUMA-spezifischer siRNA an, jedoch keine Kontrolle von nicht zielgerichteter siRNA. (C) Eine erhöhte EGFRvIII-Expression verleiht GBM-Zellen eine Resistenz gegen Apoptose.

Daher analysierten wir die zytoplasmatische / mitochondriale Verteilung von PUMA im isogenen Paar von U87MG-EGFRvIII- und U87MG-Vektorzellen. Die Mitochondrienfraktionierung / Western-Blotting (5a) zeigte, dass PUMA in erster Linie in den nicht mitochondrialen Fraktionen von U87MG-EGFRvIII-Zellen unter nicht belasteten Bedingungen lokalisiert war und sich nach Exposition gegenüber den apoptotischen Induktoren Staurosporin (ST) und einer moderaten mitochondrialen Translokalisierung unterzog Anisomycin (AN). Wie durch den niedrigen mtPUMA-Index (0-0,02) angezeigt, ist der Großteil von PUMAin den nicht mitochondrialen Fraktionen der EGFRvIII-exprimierenden U87MGEGFRvIII-Zellen sequestriert (5a).